基因结构与表达的分析

为什么是这样

读序列的经典方法是桑格法（サンガー法）。以待测单链 DNA 为模板，加入引物、DNA 聚合酶、四种普通核苷酸，再掺入少量四种双脱氧核苷酸，并给这四种分别标上不同颜色的荧光。双脱氧核苷酸的糖缺少 3′ 位的羟基，一旦被接到新链末端，下一个核苷酸就接不上，这条链的延伸在此停止。

掺入是随机的，所以反应结束时会得到在各个位置停下来的一整套新链：长度依次相差 1 个碱基，末端碱基由荧光颜色标明。按长度用电泳分开，从短到长读颜色，就是新链的序列。现在的次世代测序仪能同时读取大量片段，使整个基因组的测定变得快速、廉价。

观察表达常用两类办法。一是报告基因：把水母来源的 GFP 基因接在目的基因后面，使两者一起表达，细胞在哪里发绿光，目的基因就在哪里表达。二是测 mRNA：从组织中提取 mRNA，用逆转录酶合成 cDNA 并标上荧光，与固定着大量已知 DNA 片段的 DNA 微阵列杂交，某个点越亮，对应基因的 mRNA 越多。

定量表达

桑格法的读法有三条规则。① 长度为 k 的片段，其末端碱基就是新链从引物后数第 k 个碱基。② 片段越短跑得越远，按「从短到长」读，得到新链 5′→3′ 方向的序列。③ 模板链与新链互补（A 对 T、G 对 C）且方向相反，求模板序列要逐个取互补碱基，再把方向倒过来写。

表达分析给出的是相对量。双色微阵列中，样品甲的 cDNA 标红色荧光、样品乙标绿色，混合后杂交：某点偏红表示该基因在甲中表达较多，偏绿表示在乙中较多，黄色表示两者相近。主要读数是同一基因在两个样品之间的比值。基因组 DNA 在两种组织中相同，所以这里比较的必须是 mRNA。