基因的分离与扩增

为什么是这样

限制酶（制限酵素）只认 DNA 上特定的短序列（多为 4～8 个碱基对），并在固定位置切断双链。例如 EcoRI 识别 GAATTC，在 G 与 A 之间切开；两条链上的识别序列反向读起来相同，切口错开，两端各留下一小段单链，叫黏性末端（付着末端）。用同一种限制酶切开的两段 DNA，末端互补、可以配对，再由 DNA 连接酶（DNAリガーゼ）把骨架接上。

要让剪下的基因在细胞里复制，需要运载工具——载体（ベクター），最常用的是细菌的质粒：独立于细菌染色体、能自我复制的小型环状 DNA。把目的基因接入质粒得到重组 DNA，再导入大肠杆菌，叫转化（形質転換）。质粒上通常带有抗生素耐药基因，在含抗生素的培养基上只有导入了质粒的菌能长出来，借此筛选。

PCR 法则完全在试管里扩增：把模板 DNA、一对引物（プライマー）、四种核苷酸和耐热的 DNA 聚合酶混合，反复改变温度。引物决定复制从哪里开始，所以扩增的只是两条引物夹住的那一段。

定量表达

PCR 一轮分三步：约 95 ℃ 使双链间的氢键断开、分成单链；降到约 55～60 ℃ 让引物与互补序列结合；再升到约 72 ℃，由耐热 DNA 聚合酶从引物的 3′ 端延伸新链。理想情况下每轮目的片段翻倍，30 轮后约为 2³⁰≈1.1×10⁹ 倍，所以极微量的样品也能扩增到可检测的量。实际效率达不到 100%，这是理论上限。

产物用电泳（電気泳動）检查。DNA 的磷酸基团带负电，在琼脂糖凝胶里向正极移动；凝胶像一张网，片段越短受阻越小、跑得越远，与已知长度的标准片段并排比较就能估计长度。另外，识别 6 个碱基的限制酶在随机序列中平均每 4⁶=4096 个碱基对出现一次识别位点，识别 4 个碱基的约每 256 个出现一次。